有机肥料地衣芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 植物乳杆菌检测

在有机肥料中检测 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），需结合微生物培养、分子生物学和生化鉴定方法。以下是基于相关标准（如 NY 884-2012《生物有机肥》、GB 20287-2006《农用微生物菌剂》）的检测流程和要点：

1. 检测标准与要求

有机肥料标准：

NY 884-2012：要求有效活菌数≥0.2亿/g（复合菌剂需标明菌种）。

GB 20287-2006：规定菌剂中特定菌种的活菌数及杂菌率（如杂菌率≤10%）。

目标菌种：

芽孢杆菌属（地衣、枯草）：需检测活菌数及芽孢率。

乳杆菌属（植物乳杆菌）：需厌氧培养。

2. 检测方法 (1) 样品预处理

稀释悬浮液制备：

取10g样品 + 90mL无菌生理盐水（或PBS缓冲液），振荡30min。

梯度稀释（10⁻¹~10⁻⁶），选择适宜稀释度培养。

(2) 选择性培养基分离 菌种 培养基 培养条件 菌落特征

地衣芽孢杆菌	营养琼脂（NA）	30℃, 24-48h, 需氧	灰白色、不规则边缘
枯草芽孢杆菌	芽孢杆菌选择性培养基	37℃, 24-48h, 需氧	干燥、皱褶状
植物乳杆菌	MRS琼脂（pH 6.2）	37℃, 48h, 厌氧（罐/袋）	乳白色、圆形光滑

注意：

芽孢杆菌需进行 热激处理（80℃, 10min）以杀死营养体，仅计数芽孢。

植物乳杆菌需厌氧环境（可用厌氧培养箱或GasPak系统）。

(3) 活菌计数（平板计数法）

选择30-300菌落的平板，计算每克样品的活菌数：

活菌数（CFU/g）=平均菌落数×稀释倍数×10活菌数（CFU/g）=平均菌落数×稀释倍数×10

（示例：10⁻⁵稀释度平均菌落50个 → 活菌数=50×10⁵×10=5×10⁷ CFU/g）

(4) 确认鉴定

生化鉴定：

芽孢杆菌：过氧化氢酶试验（+）、V-P试验（枯草+，地衣-）。

植物乳杆菌：产酸试验（发酵葡萄糖产酸）。

分子生物学（可选）：

16S rRNA基因测序或PCR特异性引物（如枯草芽孢杆菌的gyrB基因）。

3. 关键质量控制

阴性对照：无菌培养基验证无污染。

阳性对照：使用标准菌株（如ATCC 6633枯草芽孢杆菌）。

杂菌率计算：

杂菌率=非目标菌落数总菌落数×（需≤10杂菌率=总菌落数非目标菌落数×（需≤10

4. 报告与判定

结果报告：

各菌种活菌数（CFU/g）、芽孢率（针对芽孢杆菌）、杂菌率。

检测方法依据（如GB 20287-2006）。

判定合格：

活菌数≥产品标注值（如0.2亿/g），且杂菌率达标。

5. 注意事项

样品保存：需冷藏（4℃）运输，24h内检测（避免菌群变化）。

干扰因素：

肥料中有机质可能抑制微生物生长（需充分稀释）。

芽孢杆菌与杂菌竞争，需依赖选择性培养基。