医用材料体外细胞毒性试验 MTT法ISO 10993-5检测
更新时间:2024-11-09 08:57:59 信息编号:34422359 发布者IP:114.219.106.206 浏览:5次- 供应商
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- 体外细胞毒性试验,ISO 10993-5
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产品详细介绍
MTT法:
1、将配制好的1×105/mL细胞悬液接种于96孔板,设空白对照、阴性对照、阳性对照和供试品组,每组各设至少6孔,每孔接种100uL细胞悬液,置CO2培养箱(含体积分数5%二氧化碳气体)37℃培养24h。
2、 培养24h后弃去原培养液,空白对照组加入新鲜细胞培养液,阴性对照组加入阴性对照品浸提液,阳性对照组加入阳性对照溶液或阳性对照品浸提液,供试品组分别加入100uL不同浓度的样品浸提液(、75%、50%、25%),置CO2培养箱继续培养24h。
3、 更换培养液24h后,置显微镜下观察细胞形态。每孔加入50uL质量浓度为1mg/mL的MTT溶液,继续培养2h后弃去孔内液体,加入100uL异丙醇,置振荡器上振荡,在酶标仪570nm和650nm波长下测定吸光度,计算相对增殖率(RGR)。
直接接触法:
1、 将已培养 48h~72h 生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养液,用移液枪吹打混匀后在显微镜下计数,将细胞悬液配制成密度 1.0×105/mL,接种于直径 35mm 培养皿,每皿 2mL,共 9 皿。置 CO2培养箱 (5%CO2,37℃,>90%湿度)培养至近汇合单层细胞形成。
2、 弃去原培养液。加入 2mL 新鲜培养基,在培养皿中央部位的细胞层上轻轻放置一片供试样品,共 3 皿。 同法操作阴性对照、阳性对照各 3 皿。置 CO2培养箱(5%CO2,37℃,>90%湿度)继续培养 24h。
3、 培养结束后,于显微镜下观察细胞形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化,根据以下标准判断试验样品分级,分级大于 2 级时被认为有细胞毒性作用。
琼脂扩散法:
1、将已培养48h~72h生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养液,用移液枪吹打混匀后在显微镜下计数,将细胞悬液配制成密度1.0×105/mL,接种于直径35mm培养皿,每皿2mL,共9皿。置CO2培养箱(5%CO2,37℃,>90%湿度)培养至近汇合单层细胞形成。
2、弃去器皿中的培养基,将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合,使琼脂Zui终质量浓度为0.5%~2%,并吸取适宜体积加入至每只培养皿内。细胞培养只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。这种琼脂/培养基的混合物宜为液态,并且温度适合于哺乳动物细胞。加入2mL中性红液并在CO2培养箱孵育30min,孵育后丢弃多余的中性红液,将试验样品的平行试样小心地放在每只培养皿的固化琼脂层上,确保试样覆盖细胞层表面约十分之一,共3皿。同法操作阴性对照、阳性对照各3皿。置CO2培养箱(5%CO2,37℃,>90%湿度)继续培养24h。
3、培养结束后,将培养皿上的试样小心地从固化琼脂层取下,于显微镜下观察培养皿中细胞形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化,根据表1判断试验样品分级,分级大于2级时被认为有细胞毒性作用。
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