Cas9蛋白稳定表达细胞系Cas9对照实验
更新时间:2015-07-09 15:05:58 信息编号:3731450 发布者IP:221.204.167.185 浏览:514次- 供应商
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- 关键词
- 慢病毒载体,基因敲除,细胞转染,载体构建,pTYNE质粒
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产品详细介绍
实验原理
pTYNE载体在EGFP编码框上游有2个错码的ATG起始密码子,由于不能有效地启动EGFP表达,pTYNE转染细胞仅能发出很微弱的荧光。我们根据pTYNE载体上错码的EGFP的上游区域设计并构建了Cas9蛋白基因敲除实验的阳性对照gRNA表达载体pGR-Hygro-P。
pTYNE载体和阳性对照gRNA表达载体共转染Cas9表达细胞,gRNA指引Cas9蛋白对pTYNE载体上的错码EGFP基因切割。细胞对断裂的DNA进行修复,产生正确的EGFP基因,发出明亮的绿色荧光。
通过pTYNE载体实验可以检测Cas9蛋白表达细胞系是否构建成功。
pGR-Hygro-P阳性对照载体靶序列:CTTCGAATTCTGCAGTCGA。该靶点位于pTYNE EGFP基因上游。
pGR-Hygro-N阴性对照载体靶序列:ATCGACTAGCCACTCAGAC。该序列为随机序列。
pGR-Hygro-P靶点在pTYNE载体上的位置:
Cas9切割原理:
pGR-Hygro载体图谱:
实验内容
1、实验材料
pTYNE质粒(验证载体,无内毒素试剂盒制备;货号:CR1011)
pGR-Hygro-P质粒(阳性对照,无内毒素试剂盒制备;货号CR1022)
pGR-Hygro-N质粒(阴性对照,无内毒素试剂盒制备;货号CR1022)
Cas9蛋白表达293T细胞系(货号:C1203)
Polyfect-V转染试剂(货号:P2010-1)
2、实验步骤
1)
转染前24小时将293T-Cas9铺到24孔板中。同时准备2个孔。
2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液
组1 |
组2 |
pTYNE 0.4ug |
pTYNE 0.4ug |
pGR-Hygro-N 0.4ug |
pGR-Hygro-P 0.4ug |
DMEM培养基X ul |
DMEM培养基 X ul |
总体积50ul |
总体积50ul |
3) 准备转染试剂稀释液:
Polyfect-V转染试剂 3.2ul
DMEM培养基 96.8ul
4)
将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中,充分混匀,室温孵育15min。
5) 将转染液加入293T-Cas9细胞。
6) 48小时后检测EGFP荧光表达。
实验结果
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- 构建稳定Cas9过表达293T细胞系品牌:英茂盛业
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- pCas9 gRNA1基因敲除载体对照实验品牌:英茂盛业