pCas9gRNA1载体敲除细胞中的TP53基因
更新时间:2015-07-09 15:04:02 信息编号:3731438 发布者IP:221.204.167.185 浏览:452次- 供应商
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- 慢病毒载体,基因敲除,细胞转染,TP53基因,载体构建
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产品详细介绍
实验原理
TP53是重要的抑癌基因。在多种肿瘤中都能发现TP53基因突变及功能丧失。我们将针对TP53基因设计的靶点构建到pCas9/gRNA1载体,转染293T细胞,构建了TP53基因敲除293T细胞系。
1、本实验基因敲除原理:pCas9/gRNA1载体表达gRNA和Cas9蛋白。将靶点序列克隆到pCas9/gRNA1载体上,gRNA将诱导Cas9蛋白对靶点DNA进行切割,造成DNA断裂。细胞通过邻端连接( nonhomologous end-joining)修复重新连接DNA,造成靶点附近DNA序列缺失突变。
Cas9切割原理:
2、pTYNE载体靶点验证原理:将包括靶点在内的大约200bp基因组序列克隆到pTYNE载体。构建好的pTYNE载体与pCas9/gRNA1基因敲除载体共转染293T细胞。如果靶点有效,基因敲除载体对pTYNE载体载体切割,经过细胞修复后pTYNE上移码突变的EGFP基因得到修复,发出绿色荧光。
3、阳性细胞筛选原理:pCas9/gRNA1载体本身不带筛选标签。我们用带有嘌呤霉素和EGFP标签的载体pLV-EGFP(2A)puro和pCas9/gRNA1载体共转染,再用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。
简要步骤
设计靶点→构建pCas9/gRNA1载体→pTYNE验证靶点→pCas9/gRNA1载体转染293T细胞→挑选培养细胞克隆→测序验证基因敲除
靶点设计和基因敲除载体构建
人TP53基因有多个mRNA和蛋白拷贝,2个转录起始位点,以及多个翻译位点。我们在TP53基因的第四外显子设计了2个CRISPR基因敲除靶点,以实现对所有TP53蛋白的编辑。
靶点序列1:acctgccctgtgcagctgt
靶点序列2:ttgattccacacccccgcc
将靶点1和靶点2构建到pCas9/gRNA1载体,获得针对TP53基因的gRNA基因敲除载体pCas9/gRNA1-P531和pCas9/gRNA1-P532。构建方法同pCas9/gRNA1使用说明中的方法。
靶点验证
1、pTYNE-53验证载体构建
为了验证基因敲除靶点的效率,我们把TP53第四外显子部分序列通过XhoI、HindIII酶切位点连接到pTYNE载体,通过pTYNE载体验证靶点的切割效率。构建完成的载体命名为pTYNE-53。
构建完成后pTYNE-53载体序列:
注: 黄色:CMV promoter;灰色:TP53第四外显子部分序列;绿色:EGFP序列;下划线:CRISPR靶点
2、用pTYNE-53验证靶点
1)
转染前24小时将293T铺到24孔板中。同时准备3个孔。
2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液
组1(阴性对照) |
组2(靶点一) |
组3(靶点二) |
pTYNE-53 0.4ug |
pTYNE-53 0.4ug |
pTYNE-53 0.4ug |
pCas9/gRNA1空载体0.4ug |
pCas9/gRNA1-P531 0.4ug |
pCas9/gRNA1-P532 0.4ug |
DMEM培养基X ul |
DMEM培养基 X ul |
DMEM培养基 X ul |
总体积50ul |
总体积50ul |
总体积50ul |
3) 准备转染试剂稀释液:
Polyfect-V转染试剂 4.8ul
DMEM培养基 145.2ul
4)
将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中,充分混匀,室温孵育15min。
5) 将转染液加入293T细胞。
6) 48小时后检测EGFP荧光表达。
验证实验结果
图一:靶点效率检测。转染48小时候荧光照片。
检测结果显示靶点一和靶点二均有效果,靶点一的效果优于靶点二。
TP53基因敲除293T细胞筛选
实验步骤
1)
转染前24小时将293T铺到6孔板中。
2) 按照下列体系制备质粒稀释液
pCas9/gRNA1-P531 0.7ug |
pLV-EGFP(2A)puro 0.1ug |
DMEM培养基X ul |
总体积50ul |
3) 准备转染试剂稀释液:
Polyfect-V转染试剂 1.6ul
DMEM培养基 48.4ul
4)
将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中,充分混匀,室温孵育15min。
5) 将转染液加入293T细胞。
6) 48小时后加入puromycin至终浓度为3ug/ml。
7)筛选3天后消化细胞,用有限稀释法将细胞接种到394孔板,标记单个细胞的孔,做单克隆细胞培养。培养时不加puromycin。
8)约7-10天,细胞形成克隆。消化细胞,将部分细胞继续培养,部分细胞提取基因组DNA检测TP53基因敲除结果。
克隆检测结果
以细胞克隆提取出的基因组DNA为模板,PCR扩增TP53第4外显子基因序列,并测序。
测序的20个克隆结果如下:
单敲除细胞克隆 |
12个 |
双敲除细胞克隆 |
2个 |
未突变细胞克隆 |
6个 |
合计 |
20个 |
测序结果截图:
用到的产品:
pTYNE载体 货号:CR1011
pCas9/gRNA1载体 货号:CR1001
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