构建稳定Cas9过表达293T细胞系

一、试剂

1. 细胞培养基及其他细胞培养所需试剂。
2. 转染辅助试剂Polybrene（用水配制为6mg/ml，-20℃冻存）。
3. Cas9表达慢病毒（制备方法见Cas9慢病毒包装实验）。
4. 嘌呤霉素或者G418。

二、实验步骤

1、 转染前24小时将293T以适当密度铺板到12孔板。感染病毒时细胞密度在80%左右。
2、 取出制备好的Cas9表达慢病毒（pLV-Cas9-Puro包装得到，制备方法见Cas9慢病毒包装实验），室温融化。按照下面的方法准备慢病毒感染液：
以感染1个12孔板细胞（细胞培养基体积1ml）为例
 病毒液 50ul
 细胞完全培养基到950ul
 加入Polybrene到终浓度为6ug/ml
3、 用病毒感染液替换原细胞培养基，继续培养24小时。用新鲜的培养基替换病毒感染液。
4、 病毒感染48小时后，转入的基因开始表达。这时可以加入嘌呤霉素至终浓度为3ug/ml。
5、 在筛选过程中为维持抗生素合适的浓度和细胞营养，每隔2-3天应该换液一次，去除死细胞，补加抗生素。
6、 大约6-7天，细胞不再死亡。扩大培养筛选得到的细胞，进行检测。

三、PCR检测细胞基因组中的Cas9基因

用基因组PCR检测293T-Cas9细胞中的Cas9基因。

鉴定引物：
Cas9-F：ACAGTCTTCACGAGCACATC
Cas9-R：TCCTCTTCATCCTTTCCCTA
产物大小198bp

步骤：

1、 分别提取293T-Cas9细胞和293T细胞的基因组DNA。
2、 PCR扩增
反应体系：
2×Taq Mix 25ul
Cas9-F（10uM）2ul
Cas9-R（10uM）2ul
基因组模板 5ul
加水补足50ul

反应条件：95℃ 预变性5min；95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环。
3、 电泳检测PCR产物

M：DL2000 DNA marker
1：293T-Cas9扩增产物
2：293T扩增产物

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