在模板及引物存在的条件下，T4 DNA聚合酶催化沿5'→3'方向合成DNA。此酶还具有3'→5'核酸外切酶的活性，该活性比DNA聚合酶I强。与DNA聚合酶I不同，T4 DNA聚合酶不具有5'→3'核酸外切酶活性。