pCas9 gRNA1基因敲除载体对照实验

更新时间:2015-07-09 15:09:17 信息编号:3731468 发布者IP:221.204.167.185 浏览:351次
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实验原理

pTYNE载体在EGFP编码框上游有2个错码的ATG起始密码子,由于不能有效地启动EGFP表达,pTYNE转染细胞仅能发出很微弱的荧光。我们根据pTYNE载体的序列设计了pCas9/gRNA1对照阳性质粒pCas9-P,该质粒上的gRNA与pTYNE上EGFP编码区上游结合。pCas9-P表达的Cas9蛋白和gRNA组合现对pTYNE载体切割,经细胞修复后,突变的pTYNE将表达出读码框正确的EGFP蛋白,发出明亮的绿色荧光。

pCas9/gRNA1阳性对照载体(pCas9-P)靶序列:CTTCGAATTCTGCAGTCGA。该靶点位于pTYNE EGFP基因上游。

pCas9/gRNA1阴性对照载体(pCas9-N)靶序列:ATCGACTAGCCACTCAGAC。该序列为随机序列。

 

pCas9-P靶点在pTYNE载体上的位置:

 

Cas9切割原理:

 

实验内容

1、实验材料

pTYNE质粒(验证载体,无内毒素试剂盒制备;货号:CR1011)
pCas9 –N质粒(pCas9/gRNA1阴性对照,货号:CR1002,无内毒素试剂盒制备)
pCas9 –P质粒(pCas9/gRNA1阳性对照,货号:CR1002,无内毒素试剂盒制备)
Polyfect-V转染试剂(货号:P2010-1)
293T细胞系

 

2、实验步骤

1) 转染前24小时将293T铺到24孔板中。同时准备2个孔。

2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液

组A

组B

pTYNE 0.4ug

pTYNE 0.4ug

pCas9 –N 0.4ug

pCas9 –P 0.4ug

DMEM培养基X ul

DMEM培养基 X ul

总体积50ul

总体积50ul

3) 准备转染试剂稀释液:

Polyfect-V转染试剂 3.2ul

DMEM培养基 96.8ul

4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中,充分混匀,室温孵育15min。

5) 将转染液加入293T细胞。

6) 48小时后检测EGFP荧光表达。

 

实验结果

 

 

 

相关产品:慢病毒载体 , 基因敲除 , 细胞转染 , pTYNE载体 , 载体构建
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