禽流感病毒RT-PCR检测试剂盒
更新时间:2013-10-21 16:36:42 信息编号:2501715 发布者IP:61.140.108.59 浏览:74次![](http://image.11467.com/10/21/16354885684.jpg)
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产品详细介绍
禽流感病毒rt-pcr检测试剂盒使用说明书
产品咨询联系电话:020-82569399
【试剂盒简介】
禽流感病毒rt-pcr 检测试剂盒,采用反转录聚合酶链反应(rt-pcr )技术检测禽组织、分泌物和排泄物中所有亚型的aiv,适用于aiv的检测、诊断和流行病学调查。
【原理】
利用吸附柱提取rna作为模板,在反转录酶的作用下,以引物为起点合成与rna 模板互补的cdna链;然后在dna 聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环,使特异dna 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的dna 片段进行电泳、染色后,在紫外灯下,肉眼可见dna 片段的扩增带。
【试剂盒组份】
1. 生理盐水 |
20ml |
8. 吸附柱和收集管 |
10套 |
2. 裂解液 |
6ml |
9. 0.2 ml 薄壁pcr 管 |
15个 |
3. 洗涤液a |
7ml |
10. rt-pcr 反应液a |
180μl |
4. 洗涤液b |
7ml |
11. rt-pcr 反应液b |
50μl |
5. 洗脱液 |
500μl |
12. 50 倍tae 电泳缓冲液 |
20ml |
6. 阴性对照 |
300μl |
13. 染色液 |
10μl |
7. 阳性对照 |
300μl |
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|
注:塑料袋内试剂(阳性对照、rt-pcr反应液a和b)-20 ℃冻存,裂解液2-8℃冷藏,其他室温保存。
【操作方法】
一、样品制备
1样品采集:病死或扑杀的禽,取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织;待检活禽,用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物,置于50%甘油生理盐水中,2~8 ℃保存。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融。)
2样品处理:
2.1 组织样品的处理:称取组织0.1g于研磨器中磨碎,再加1ml生理盐水继续磨至无块状物;然后将样品转至1.5 ml灭菌离心管中,8000 rpm离心2 min,取100 µl上清于1.5 ml 灭菌离心管中。
2.2 全血样品的处理:待血凝后取100 µl血清于1.5 ml 灭菌离心管中。
2.3 阳性对照的处理:取阳性对照 100 µl于1.5 ml 灭菌离心管中。
2.4 阴性对照的处理:取阴性对照100 µl于1.5 ml 灭菌离心管中。
二、病毒rna的提取
1. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照,分别加入450µl裂解液,充分颠倒混匀,室温静置3min 。
2. 加入275µl无水乙醇,轻轻混匀。
3. 将混合液吸入吸附柱中(吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质,以免离心时堵塞吸附柱),10,000 rpm 离心1min,弃去收集管中液体,套回收集管。
4. 向吸附柱中加入500µl洗涤液a,10,000 rpm 离心1min,弃去收集管中液体,套回收集管。
5. 向吸附柱中加入500µl洗涤液b,10,000 rpm 离心1min,弃去收集管中液体,套回收集管。
6. 空柱10,000 rpm 离心2 min。
7. 将吸附柱移入新的无rna酶的1.5 ml离心管中,在膜中央加入30µl洗脱液,室温静置2min,10,000 rpm 离心1min,获得总rna。
三、rt-pcr
1. 反应体系:分别取14µl rt-pcr反应液a(用前混匀)、4µl rt-pcr反应液b(用前混匀)和2µl模板rna,混匀。
2. 反应程序:在pcr仪上运行以下程序:42 ℃ 45 min,94 ℃ 3 min ;94 ℃ 30 s 、53℃ 30 s 、72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。
四、电泳
1. 制胶:用50倍稀释的tae电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。
2. 电泳:待胶凝固后,取5µl pcr扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中,以5v/cm的电压于50 倍稀释的tae 电泳缓冲液中电泳。
3. 染色:取50 倍稀释的tae 电泳缓冲液30ml,加入10µl染色液,混匀后将胶浸泡30min,于紫外灯下观察结果。
【结果判断】
阳性对照出现400bp扩增带,阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为禽流感病毒阳性,否则为阴性。
【需用但未提供的材料】
组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、经焦碳酸二乙酯(depc )处理的灭菌1.5ml 离心管和吸头(10 µl、200 µl、1000 µl)。
【注意事项】
1.本试剂盒有效期为6个月,不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的组分不要混用。
2.所有试剂应在规定的温度储存,使用时拿到室温下,使用后立即放回。
3.注意防止试剂盒组分受污染。使用前将塑料袋内试剂瞬离15s,使液体全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。
4.严格按试剂盒说明书操作可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须。
5.rna提取过程中,应戴口罩、勤换手套,尽量缩短操作时间。
6.所有接触病料的物品均应合理处理,以免污染实验室。
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