猪伪狂犬病毒PCR检测试剂盒
更新时间:2023-05-08 00:55:17 信息编号:2495891 发布者IP:61.144.146.103 浏览:64次![](http://image.11467.com/10/9/11165981998.jpg)
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产品详细介绍
伪狂犬病毒pcr检测试剂盒使用说明
产品咨询联系电话:020-82569399
【试剂盒简介】
猪伪狂犬病毒pcr 检测试剂盒,采用聚合酶链反应(pcr )技术检测猪血清和组织中的prv,适用于prv的检测、诊断和流行病学调查。
【原理】
提取dna作为模板,在dna 聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环,使特异dna 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的dna 片段进行电泳、染色后,在紫外灯下,肉眼可见dna 片段的扩增带。
【试剂盒组份】
1. 裂解液 |
8ml |
8. 阳性对照 |
|
2. 蛋白酶k |
110μl |
9. 0.2 ml 薄壁pcr 管 |
15个 |
3. 抽提液 |
8ml |
10. pcr 反应液a |
180μl |
4. 异丙醇 |
7ml |
11. pcr 反应液b |
50μl |
5. 洗涤液 |
12ml |
12. 50 倍tae 电泳缓冲液 |
20ml |
6. 无菌水 |
500μl |
13. 染色液 |
|
7. 阴性对照 |
300μl |
|
10μl |
注:塑料袋内试剂(阳性对照、蛋白酶k、pcr反应液a和b)-20 ℃冻存,其他室温保存。
【操作方法】
一、样品制备
1样品采集:病死或扑杀的猪,取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、扁桃体、淋巴结等组织;待检活猪,用棉拭子取鼻腔分泌物,置于50%甘油生理盐水中,或用注射器取血5 ml,2~8 ℃保存。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融。)
2样品处理:
2.1 组织样品的处理:称取组织0.1g于研磨器中磨碎,再加1ml生理盐水继续磨至无块状物;然后将样品转至1.5 ml灭菌离心管中,8000 rpm离心5 min,取上清100 µl于1.5 ml 灭菌离心管中,加入500 µl裂解液和10 µl蛋白酶k,混匀后37℃温育1h。
2.2 全血样品的处理:待血凝后取血清放于离心管中,8000 rpm离心5 min,取上清100 µl于1.5 ml 灭菌离心管中,加入500 µl裂解液和10 µl蛋白酶k,混匀后37℃温育1h。
2.3 阳性对照的处理: 混匀后取100 µl于1.5 ml 灭菌离心管中,加入500 µl裂解液和10 µl蛋白酶k,混匀后37℃温育1h。
2.4 阴性对照的处理: 混匀后取100 µl于1.5 ml 灭菌离心管中,加入500 µl裂解液和10 µl蛋白酶k,混匀后37℃温育1h。
二、病毒dna的提取
1. 取出已处理的样品、阴性对照和阳性对照,分别加入600µl抽提液(用抽提液之前不要晃动,不要吸到上层保护液),用力颠倒10次混匀,12,000 rpm 离心10min。
2. 取500µl上清置于灭菌离心管中,加入500µl异丙醇,混匀,置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出样品管,室温融化,13,000 rpm 离心15min。
3. 弃上清,沿管壁缓缓加入1ml 洗涤液,轻轻旋转一周后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上1min,再将离心管真空抽干15min或37℃烘干。
4. 用30µl无菌水溶解沉淀,作为模板备用。
三、pcr
1. 反应体系:分别取16µl pcr反应液a(用前混匀)、2µl pcr反应液b(用前混匀)和2µl模板dna,混匀。
2. 反应程序:在pcr仪上运行以下程序: 94 ℃ 3 min ;94 ℃ 30 s 、55℃ 30 s 、72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。
四、电泳
1. 制胶:用50倍稀释的tae电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。
2. 电泳:待胶凝固后,取5µl pcr扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中,以5v/cm的电压于50 倍稀释的tae 电泳缓冲液中电泳。
3. 染色:取50 倍稀释的tae 电泳缓冲液30ml,加入10µl染色液,混匀后将胶浸泡30min,于紫外灯下观察结果。
【结果判断】
阳性对照出现400bp扩增带,阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为猪伪狂犬病毒阳性,否则为阴性。
【需用但未提供的材料】
组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、灭菌1.5ml 离心管和吸头(10 µl、200 µl、1000 µl)。
【注意事项】
1.本试剂盒有效期为6个月,不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的组分不要混用。
2.所有试剂应在规定的温度储存,使用时拿到室温下,使用后立即放回。
3.注意防止试剂盒组分受污染。使用前将塑料袋内试剂瞬离15s,使液体全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。
4.严格按试剂盒说明书操作可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须。
5.所有接触病料的物品均应合理处理,以免污染实验室。
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