T4 Polynucleotide Kinase能够催化ATP的γ-磷酸基团转移到寡核苷酸链(双链或单链DNA或RNA)的5'-羟基末端以及3'-单磷酸核苷上。T4 Polynucleotide Kinase还具有3'-磷酸酶活性,将3'-磷酸基团从寡核苷酸的3'磷酸末端、脱氧3'-单磷酸核苷和脱氧3'-二磷酸核苷上水解掉。