黄曲霉毒素M1（AFM1）ELISA 检测试剂盒

 一、检测原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA 方法，样品中游离的黄
曲霉毒素M1 与酶标板上固相包被的黄曲霉毒素M1 抗原
竞争结合特异性抗体，酶标二抗可与抗体反应，再通过酶
的专一性显色剂显色，因为酶可以使无色的显色剂转变成
蓝色，终止液的加入可以终止显色，蓝色转变成黄色，吸
收值可以在450nm 处进行测定。颜色变化的程度反映样品
中黄曲霉毒素M1 的含量。
二、检测范围
本试剂盒是应用ELISA 技术研发的药物残留检测产品,
与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出液态奶、奶
粉、酸奶、奶酪等样本中的黄曲霉毒素M1。
三、交叉反应率
黄曲霉毒素M1…………………………………
四、试剂盒组成
酶标板1 块，96 孔/板
标准液6 瓶（1ml/瓶）：
0 ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45 ppb、1.35 ppb、4.05 ppb
抗体工作液……………………………………………5mL
酶标记物……………………………………………10mL
底物液A ……………………………………………7mL
底物液B ……………………………………………7mL
终止液…………………… ..……… ………… .. .…7mL
10× 浓缩酸奶样品稀释液………………………5mL
10× 浓缩洗涤液………………….…...…………40mL
2× 浓缩样品稀释液………………. ..…………50mL
说明书…… … … … … … … . . … … … . .… … … 1 份
五、使用单位需自备的设备及试剂
（1）仪器
微孔板酶标仪(450 nm/630 nm)
振荡器；离心机；涡旋仪；
电子天平（感量0.01 g）
（2）器材
单道微量移液器：20 μL～200 μL，100 μL~1000 μL
多道微量移液器：30 μL～300 μL
（3）试剂
去离子水
五、溶液的配制
配液1: 样品稀释液
用去离子水将浓缩样品稀释液按1：1 体积比进行稀释，
即1 份浓缩样品稀释液加1 份去离子水。
配液2: 洗涤工作液
用去离子水将浓缩洗涤液按1：9 体积比进行稀释，即
1 份浓缩洗涤液加9 份去离子水，用于酶标板的洗涤，
洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。
配液3: 酸奶样品稀释液：将浓缩酸奶样品稀释液用去离子
水按1:9 体积比进行稀释（1 份浓缩酸奶样品稀释液
+9 份去离子水）。
配液4：样品提取液：将甲醇和浓缩样品稀释液按1:3 体积
比例进行混匀（1 份甲醇+3 份浓缩样品稀释液）。
六、样本前处理方法
样本处理前须知：
（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要
更换吸头。
（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁
净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理步骤：
（一）液态奶（含生鲜奶及成品液态奶）
1、取待测样品，3000rmp 室温下离心10min（除去脂肪层）；
2、下层500μL 待测样本，加入500μL 样品稀释液混匀2min；
3、取下层50μL 用于分析。
稀释倍数：2
（二）酸奶
1、称取0.5g 待测样品，加入500μL 酸奶样品稀释液，混
匀2min；
2、7000rmp 室温下离心10min
3、取下层50 μL 用于分析。
稀释倍数：2
（三）奶粉
1、称取1 g 样品，加入6mL 乙腈，混匀2min；
2、3000rpm 室温下离心，10min；取上清3ml，50℃氮吹；
3、加入0.5ml 浓缩样品稀释液复溶，再加入0.5ml 正己烷
混匀2min，3000rpm 室温下离心，5min；
4、取下层50μL 用于分析。
稀释倍数：1
（二）奶酪
1、取1g 研磨后的奶酪，加入6ml 甲醇，7000rpm 室温下
离心，5min；
2、取下层2ml，60℃氮吹；
3、加入1ml 石油醚，再加入2ml 样品提取液，混匀2min；
4、5000rpm 室温下离心，5min；
5、取下层50 μL 用于分析。
稀释倍数：6
七、酶联免疫检测步骤
测定前须知：
1、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。
2、使用之后立即将所有试剂放回2~8 ℃。
3、在使用中不要让微孔干燥。
4、在ELISA 分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一
致性，正确的洗板操作是ELISA 测定程序中的要点。
5、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住
微孔板。
测定步骤：
1、将所需试剂和微孔板从冷藏环境中取出，在室温下平衡
30 min，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2
个平行试验。
2、加标准品：加入标准品/样品50 μL/孔，再加抗体工作液
50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖好，室温25 ℃下
避光反应15 min。
3、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液300
μL/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗涤4~5 次，用吸水纸
拍干。
4、加结合物：加入酶标记物100 ??L/孔，轻轻振荡混匀，用
盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min，取出重复
洗板步骤3。
5、显色：每孔先各加入底物液A 50 μL，再各加入底物液B
50 μL，轻轻振荡混匀，并在室温25℃下避光反应10~15
min。
6、测定：每孔各加50 μL 终止液，设定酶标仪在450 nm 处，
测定OD 值（建议用450/630 nm 双波长检测，在5 min
内读完数据）。
八、结果分析
所测得的标准液或样品吸光度的平均值（B）除以
第一个标准液（0 标准液）的吸光度（B0）值再乘以，
得到百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝
B
B
0
??
以标准品浓度的10 为底的对数为X 轴， 百分吸光
值为Y 轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标
准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10 的
幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含黄曲霉毒素M1 的量。
利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品
的准确、快速分析。
九、试剂盒灵敏度、准确度、精密度
灵敏度：0.05 ppb
检测限：
液态奶…………………………………0.1ppb
酸奶……………………………………0.1pb
奶粉…………………………………0.25ppb
奶酪…………………………………0.3pb
回收率：80±15%
精密度：试剂盒的变异系数均小于10%
十、注意事项
1、室温低于20 ℃或试剂及样本没有回到室温（20~
25 ℃）会导致所有标准的OD 值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标
准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板拍干
后应立即进行下一步操作。
3、反应终止液为2M 硫酸，避免接触皮肤；若不慎滴漏
到皮肤上，请尽快用水冲洗。
4、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有
效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的
试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号
试剂盒中的试剂。
5、保存试剂盒于2~8 ℃，不要冷冻，将不用的微孔板放
进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏
感，因此要避免直接暴露在光线下。
6、显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之；0
标准的吸光度（450 nm）值小于0.5（A450nm< 0.5）时，
表示试剂可能变质。
7、在加入底物液后，一般显色15 min 即可。若颜色较
浅，可延长反应时间到20 min（或更长），但不得超
过30 min；反之，则减短反应时间。
8、该试剂盒反应温度为25 ℃是特好的，温度过高或过低将
导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
十一、贮藏条件及保存期
贮藏条件：在2~8 ℃保存试剂盒。
保存期：本试剂盒有效期为12 个月。